Abstract

Background. This report concerns the catalytic properties of enolase, a glycolysis pathway enzyme, obtained from the cytoplasm of Klebsiella pneumoniae cells. Comparative analysis of this enzyme with human muscle−specific enolase was performed. For both enzymes, optimal pH and KM and kcat values were determined and their activation by divalent cations and the inhibitory effects of fluoride and phosphate ions were studied.
Material and Methods. Homogeneous enzymes from the cytosol of K. pneumoniae cells and human muscle, with specific activities of 31 and 75 U/mg, respectively, were obtained according to methods presented previously.
Results. K. pneumoniae enolase catalyzed the conversion of 2−phospho−D−glycerate (2−PGA) to phosphoenolpyruvate (PEP) at pHopt 7.8, with KM = 0.425 mM and kcat = 52.7 s−1. Divalent cations were found to be obligatory for bacterial enzyme activity, but with an excess of Mg2+, Mn2+, or Zn2+ ions an inhibitory effect was observed, with KI values of 3.249, 1.266, and 2.34, respectively. Maximal specific activity with respect to 2−PGA was achieved in the presence of 1 mM Mg2+. In addition, magnesium showed the greatest kcat (68.85 s−1) of the activated reaction. The inhibition of K. pneumoniae enolase by phosphate and fluoride ions for 2−PGA→PEP conversion was established. At a high phosphate concentration, noncompetitive inhibition was found and at a lower concentration competitive inhibition, with KI values of 55 mM and 2.2 mM, respectively. The inhibitory effect of fluoride alone was noncompetitive, but it was competitive in the presence of a low phosphate level and KI values changed from 0.90 mM to 0.18 mM.
Conclusion. The kinetic parameters of K. pneumoniae cytosolic enolase and human muscle−specific enolase determined here indicate that both enzymes have similar essential catalytic properties, comparable to enolases from other sources. K. pneumoniae enolase is activated by Mg2+, Mn2+, and Zn2+ ions, but with less efficiency than the human muscle−specific enzyme. The bacterial enzyme appeared to be more sensitive to inhibition by an excess of Mg2+ and Mn2+ ions, but a weaker effect in the presence of Zn2+ compared with Mn2+ was observed. The KI values determined for both enolases with fluoride ions alone revealed that the bacterial enzyme is more resistant to inhibition by fluoride than the human enzyme. Enolase from K. pneumoniae, like the human enzyme, also reveals more susceptibility to fluoride in the presence of a low concentration of phosphate, but the KI values show that bacterial enzyme formed a weaker complex with Funder those conditions. The K. pneumoniae and human muscle−specific enolases preserved catalytic function stability despite the large distance between these two proteins in the phylogenic tree, which suggests highly conservative structures of their catalytic center.

Streszczenie

Wprowadzenie. W doniesieniu przedstawiono katalityczne właściwości enzymu szlaku glikolizy, enolazy z cytoplazmy komórek bakteryjnych Klebsiella pneumoniae oraz porównano je z wartościami otrzymanymi dla enolazy mięśniowo−specyficznej człowieka. Określono wartości optimum pH, Km, kcat oraz zbadano zjawisko aktywacji przez kationy dwuwartościowe i wpływ hamujący jonów fosforanowych i fluorków.
Materiał i metody. Wdoświadczeniach stosowano homogenną enolazę bakterii K. pneumoniae i mięśniową człowieka o aktywności specyficznej, odpowiednio: 31 U/mg i 75 U/mg. Enzymy oczyszczano według metod opisanych w poprzednim doniesieniu.
Wyniki. Enolaza z komórek bakteryjnych Klebsiella pneumoniae katalizuje przemianę 2−fosfo−D−glicerynianu (2−PGA) w fosfoenolopirogronian (PEP) w pHopt 7,8, z KM 0,425 mM i kcat 52,7 s−1. Kationy dwuwartościowe są niezbędne do zachowania aktywności enzymu, ale przy nadmiarze jonów Mg2+, Mn2+ lub Zn2+ obserwowano działanie hamujące z KI, odpowiednio: 3,249, 1,266 i 2,34 mM. W obecności 1 mM Mg2+ enzym wykazywał maksymalną aktywność katalityczną i osiągał najwyższą kcat – 68,85 s−1. Badano hamowanie enolazy bakteryjnej przez jony fosforanowe i fluorkowe. W zakresie wysokich stężeń fosforanów wykazano wobec substratu 2−PGA hamowanie niekompetycyjne, a w zakresie niższych – kompetycyjne, z KI odpowiednio: 55 mM i 2,2 mM. Inhibicja aktywności enzymu przez jony fluoru miała charakter niekompetycyjny, ale w obecności małego stężenia fosforanów zmieniała się na kompetycyjny, a KI osiągała wartości, odpowiednio: 0,90 mM i 0,18 mM.
Wnioski. Kinetyczne parametry enolazy cytozolowej K. pneumoniae i mięśniowej enolazy ludzkiej określone w tych badaniach wskazują, że oba enzymy mają podobne zasadnicze własności, porównywalne do enolaz z innych organizmów. Enolaza z komórek K. pneumoniae jest aktywowana przez jony Mg2+, Mn2+ i Zn2+, ale z mniejszą skutecznością niż ludzki enzym mięśniowo−specyficzny. Bakteryjna enolaza wydaje się ponadto bardziej wrażliwa na hamowanie przez nadmiar jonów Mg2+ i Mn2+, ale hamujący wpływ kationów cynku jest słabszy w porównaniu z działaniem manganu. Wartości KI określone dla obu enolaz wobec jonów fluorkowych wskazują, że enzym bakteryjny jest bardziej oporny na hamowanie przez fluorki niż enzym ludzki. Enolaza z bakterii K. pneumoniae wykazuje, podobnie jak enolaza ludzka, większą podatność na hamowanie fluorkami w obecności małych stężeń jonów fosforanowych. Wartości KI wskazują jednak, że enzym bakteryjny w tych warunkach tworzy słabsze, niż ludzki, kompleksy z inhibitorem. Bakteryjna i ludzka enolaza zachowują stabilną funkcję katalityczną mimo dużej odległości obu białek w drzewie filogenetycznym, co świadczy o wysokiej konserwatywności struktur ich centrów katalitycznych.