Advances in Clinical and Experimental Medicine

Title abbreviation: Adv Clin Exp Med
JCR Impact Factor (IF) – 2.1
5-Year Impact Factor – 2.2
Scopus CiteScore – 3.7 (CiteScore Tracker 3.3)
Index Copernicus  – 161.11; MNiSW – 70 pts

ISSN 1899–5276 (print)
ISSN 2451-2680 (online)
Periodicity – monthly

Download original text (EN)

Advances in Clinical and Experimental Medicine

2009, vol. 18, nr 1, January-February, p. 71–78

Publication type: original article

Language: English

Enolase from Klebsiella pneumoniae and Human Muscle Cells. I. Purification and Comparative Molecular Studies

Enolaza z komórek Klebsiella pneumoniae i mięśniowa enolaza ludzka. I. Oczyszczanie i porównawcze badania właściwości molekularnych

Iwona Bednarz−Misa1,, Jadwiga Pietkiewicz1,, Teresa Banaś1,, Andrzej Gamian1,2,

1 Department of Medical Biochemistry, Wroclaw Medical University, Poland

2 Institute of Immunology and Experimental Therapy, Polish Academy of Sciences, Wrocław, Poland

Abstract

Background. This report concerns the glycolytic enzyme enolase from the cytoplasm of Klebsiella pneumoniae bacterial cells and its similarity with human muscle−specific enzyme.
Material and Methods. Human muscle−specific enolase was purified from crude extract using standard chromatographic techniques, but this procedure was unsuccessful for isolation of bacterial enzyme. Gel filtration on a Sephadex G−100, anion−exchange chromatography on a DEAE−Sephadex A−50 column, and preparative electrophoresis were applied to obtain an electrophoretically homogenous cytosolic protein from K. pneumoniae cells.
Results. Human muscle−specific enolase was purified 83−fold with a specific activity of 75 U/mg. The new procedure resulted in a 76−fold purification of bacterial enolase, with a recovery rate of 14% and specific activity of 31 U/mg. The purified protein analyzed in SDS−PAGE appeared as a single band with a molecular mass of 47 kDa. A similar molecular weight (45 kDa) for the human enolase monomer was obtained. The molecular mass of the native K. pneumoniae enolase was estimated to be 94 kDa.
Conclusion. Although the specific activity of purified K. pneumoniae enolase is half that observed for human muscle−specific enzyme, the application of preparative gel electrophoresis for the purification of the bacterial enolase permits obtaining a homogenous enzyme with relative good recovery. The results presented in this report indicate that both enzymes have a dimeric native structure, comparable to enolases from other sources. In the second part of these investigations the kinetic differences between the bacterial and human muscle−specific enolase will be presented.

Streszczenie

Wprowadzenie. Doniesienie dotyczy glikolitycznego enzymu enolazy z cytoplazmy komórek bakteryjnych K. pneumoniae i jego podobieństwa z ludzką enolazą mięśniowoswoistą.
Materiał i metody. Enolazę mięśniowoswoistą człowieka otrzymywano, stosując standardowe techniki chromatograficzne, ale były one nieskuteczne w wydzielaniu enzymu bakteryjnego. W celu uzyskania homogennego białka cytozolowego z komórek K. pneumoniae wykorzystano filtrację żelową na Sephadex G−100, chromatografię jonowymienną w żelu DEAE Sephadex A−50 i elektroforezę preparatywną
Wyniki. Wprocedurze wydzielania enolazy mięśniowoswoistej człowieka otrzymano enzym jednorodny, o aktywności specyficznej 75 U/mg i 83−krotnym stopniu oczyszczenia. W opracowanej nowej metodzie izolowania enzymu bakteryjnego uzyskano 76−krotne oczyszczenie, z wydajnością 14% i aktywnością specyficzną 31 U/mg. Analizowane metodą SDS−PAGE oczyszczone białko ujawniło się jako pojedynczy prążek o ciężarze cząsteczkowym 47 kDa. Dla monomeru enolazy ludzkiej określono niższy ciężar cząsteczkowy – 45 kDa. Masę cząsteczkową natywnej enolazy K. pneumoniae określono w warunkach elektroforezy niedenaturującej jako 94 kDa, co wskazuje na dimeryczną strukturę cząsteczki.
Wnioski. Mimo że specyficzna aktywność oczyszczonej enolazy K. pneumoniae jest dwukrotnie niższa od wartości otrzymanej dla enolazy mięśniowej człowieka, zastosowanie preparatywnej elektroforezy żelowej w oczyszczaniu enzymu bakteryjnego pozwoliło uzyskać homogenny enzym ze względnie dobrą wydajnością. Zaprezentowane w tym doniesieniu wyniki wskazują, że oba enzymy mają w formie natywnej dimeryczną strukturę, podobnie jak enolazy z innych źródeł. W drugiej części niniejszych badań zostaną przedstawione różnice kinetyczne między bakteryjną i mięśniowoswoistą enolazą człowieka.

Key words

enolase, enzyme purification, preparative gel electrophoresis, molecular properties, Klebsiella pneumoniae

Słowa kluczowe

enolaza, oczyszczanie enzymów, elektroforeza preparatywna, właściwości cząsteczkowe, Klebsiella pneumoniae

References (26)

  1. Wold F: Enolase. In: The Enzymes, Boyer, P.D. (ed), Acad. Press, New York 1971, 5, 499–538.
  2. Rider CC, Taylor TB: Enolase isoenzymes in rat tissues. Electrophoretic, chromatographic, immunological and kinetic properties. Biochim Biophys Acta 1974, 365, 285–300.
  3. Pancholi V: Multifunctional alpha−enolase: its role in diseases. Cell Mol Life Sci 2001, 58, 902–920.
  4. Lebioda L, Stec B: Mechanism of enolase: the crystal structure of enolase−Mg2(+)2−phosphoglycerate/phosphoenolpyruvate complex at 2.2−Å resolution. Biochemistry 1991, 30, 2817–2822.
  5. Tracy MR, Hedges SB: Evolutionary history of the enolase gene family. Gene 2000, 259, 129–138.
  6. Piast M, Kustrzeba−Wójcicka I, Matusiewicz M, Banaś T: Molecular evolution of enolase. Acta Biochim Pol 2005, 52, 507–513.
  7. Schurig H, Rutkat K, Rachel R, Jaenicke R: Octameric enolase from the hyperthermophilic bacterium Termotoga maritima: Purification, characterization, and image processing. Protein Sci 1995, 4, 228–236.
  8. Ehinger S, Schubert WD, Bergmann S, Hammerschmidt S, Heinz DW: Plasmin(ogen)−binding α−enolase form Streptococcus pneumoniae: crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)−binding sites. J Mol Biol 2004, 343, 997–1005.
  9. Hüther FJ, Psarros N, Duschner H: Isolation, characterization and inhibition kinetics of enolase from Streptococcus rattus FA−1. Infect Immun 1990, 58, 1043–1047.
  10. Pietkiewicz J, Kustrzeba−Wójcicka I, Wolna E: Purification and properties of enolase from carp (Cyprinus Carpio). Comparison with enolases from mammals’ muscles and yeast. Comp Biochem Physiol B 1983, 75, 693–698.
  11. Baranowski T, Wolna, E: Enolase from human muscle. In: Methods in Enzymology. Eds.: Colowick SP, Kaplan NO, Acad. Press, New York 1975, Vol. XLII, pp. 335–338.
  12. Kustrzeba−Wójcicka I, Golczak M: Enolase from Candida albicans – purification and characterization. Comp Biochem Physiol B 2000, 126, 109–120.
  13. Witkowska D, Pietkiewicz J, Szostko B, Danielewicz R, Masłowski L, Gamian A: Antibodies against human beta−enolase recognize a 45−kDa bacterial cell wall outer membrane protein. FEMS Immunol Med Microbiol 2005, 45, 53–56.
  14. Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680–685.
  15. Kustrzeba−Wójcicka I, Pietkiewicz J, Wolna E: Studies on immunological properties of enolase from carp muscles after chemical modification of some aminoacid residues. Arch Immunol Ther Exp 1986, 34, 93–99.
  16. Merkulova T, Lucas M, Jabet C, Lamandé N, Rouzeau J−D, Gros F, Lazar M, Keller A: Biochemical characterization of the mouse muscle−specific enolase: developmental changes in electrophoretic variants and selective binding to other proteins. Biochem J 1997, 323, 791–800.
  17. Kornblatt MJ, Zheng SX, Lamande N, Lazar M: Cloning, expression and mutagenesis of a subunit contact of rabbit muscle−specific (ββ) enolase. Biochim Biophys Acta 2002, 1597, 311–319.
  18. Chai G, Brewer JW, Lovelace LL, Aoki T, Minor W, Lebioda L: Expression, purification and the 1.8 Å resolution crystal structure of human neuron specific enolase. J Mol Biol 2004, 341, 1015–1021.
  19. Dannelly HK, Reeves HC: Purification and characterization of enolase from Escherichia coli. Curr Microbiol 1988, 17, 265–268.
  20. Kaufmann M, Bartholmes P: Purification, characterization and inhibition by fluoride of enolase from Streptococcus mutans DSM 320523. Caries Res 1992, 26, 110–116.
  21. Marangos JP, Zis AP, Clark RL, Goodrin FK: Neuronal, non−neuronal and hybrid forms of enolase in brain: structural immunobiological and functional comparision. Brain Res 1978, 150, 117–33.
  22. Brown CK, Kuhlman PL, Mattingly S, Slates K, Calie JP, Farrar WW: A model of the quaternary structure of enolases, based on structural and evolutionary analysis of the octameric enolase from Bacillus subtilis. J Protein Chem 1998, 17, 855–866.
  23. Sijbradi R, Blaauwen TD, Tame JR, Oudega B, Luirnh J, Otto BR: Characterization of an iron−regulated alpha−enolase of Bacteroides fragilis. Microb Infect 2005, 7, 9–18.
  24. Bergmann S, Rhode M, Chhatwal GS, Hammerschmidt S: α−Enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)−binding protein displayed on the bacterial cell surface. Mol Microbiol 2001, 40, 1273–1287.
  25. Polidori E, Saltarelli R, Ceccaroli P, Buffalini M, Pierleoni R, Palma F, Bonfante P, Stocchi V: Enolase from the ectomycorrhizal fungus Tuber borchii Vittad.: biochemical characterization, molecular cloning, and localization. Fungal Genet Biol 2004, 41, 157–167.
  26. Cali L, Feo S, Oliva D, Giallongo A: Nucleotide sequence of a cDNA encoding the human muscle−specific enolase (MSE). Nucleic Acids Res 1990, 18, 1893.