Abstract

Background. The mechanism of the antibacterial activity of tetracyclines consists in protein biosynthesis inhibition. Resistance to these drugs is caused either by modification of tetracycline’s ribosomal target site or by the activity of efflux pumps which extrude the antibiotic from the bacterial cell. Reserpine is one of the known efflux pump inhibitors. It is unknown to what extent the efflux mechanism determines tetracycline resistance among the S. aureus strains isolated from patients in Wrocław. The aim of this study was to identify transporters which remove tetracycline from S. aureus cells.
Material and Methods. The level of tetracycline resistance was determined in S. aureus by serial antibiotic dilutions in solid media and by estimating MIC according to NCCLS guidelines. The tetracycline resistance genes tet(K), tet(L), and tet(M), tet(O) were detected by PCR. Tetracycline accumulation in cells was measured using a radioactively labeled form of it by a method described elsewhere.
Results. Of the tetracycline efflux pump genes, only tet(K) was identified. The second resistance determinant with regard to the frequency of occurrence was tet(M), wchich is responsible for a tetracycline target side modification In the strains with the efflux system, application of a pump inhibitor caused an increase in tetracycline accumulation in the cell. In contrast, the tetracycline cell concentration was decreased in the strains which did not possess the efflux mechanism.
Conclusion. In the patient−derived strains of S. aureus, efflux−dependent tetracycline resistance determined by the Tet(K) transporter was found to predominate. In the strains with a high level of tetracycline resistance, the transporter coexisted with Tet(M) protein, responsible for antibiotic target−site modification. A study using a radioisotopic method indicated that another, as yet unknown pump for tetracycline removal exists in S. aureus cells.

Streszczenie

Wprowadzenie. Mechanizm przeciwbakteryjnego działania tetracyklin polega na inhibicji biosyntezy białka. Oporność na tę grupę antybiotyków u S. aureus jest wywołana modyfikacją miejsca ich docelowego działania w rybosomie lub aktywnością pomp wyrzucających antybiotyk na zewnątrz komórki. Inhibitorem pomp jest m.in. rezerpina. Nie ustalono, jak często mechanizm aktywnego wypływu decyduje o oporności na tetracykliny u szczepów Staphylococcus aureus izolowanych od chorych z Wrocławia.
Cel pracy. Identyfikacja pomp usuwających tetracyklinę z komórek S. aureus.
Materiał i metody. Poziom oporności S. aureus na tetracyklinę określono metodą seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu stałym, ustalając wartość MIC antybiotyku wg zaleceń NCCLS. Obecność genów tet(K), tet(L) oraz tet(M), tet(O) stwierdzono za pomocą techniki PCR. Wewnątrzkomórkową akumulację tetracykliny mierzono z użyciem znakowanego izotopowo antybiotyku wg metody opisanej przez Wondrack et al.
Wyniki. Spośród genów kodujących pompy dla tetracykliny, zidentyfikowano tylko tet(K). Drugą, co do częstości występowania, determinantą genetyczną był gen tet(M), odpowiadający za zmianę miejsca docelowego działania antybiotyku. U szczepów posiadających mechanizm aktywnego wypływu (efflux) zastosowanie inhibitora pomp powodowało wzrost kumulacji tetracykliny w komórkach, a u szczepów pozbawionych tego mechanizmu obserwowano zmniejszanie wewnątrzkomórkowego stężenia antybiotyku.
Wnioski. U szczepów S. aureus izolowanych z terenu Wrocławia dominującym mechanizmem oporności na tetracykliny jest aktywny wypływ antybiotyku zależny od transportera Tet(K). U szczepów wysoko opornych współ− występuje on z białkami Tet(M) modyfikującymi miejsce docelowego działania tej grupy antybiotyków. Badania izotopowe wskazują również na obecność w komórkach badanych szczepów innego nieznanego dotąd transportera usuwającego tetracykliny.